什么叫做單細(xì)胞基因測序（Single-Cell Sequencing）？
一句話說，就是單個(gè)細(xì)胞水平上對基因組進(jìn)行測序。2013年，自然雜志把年度技術(shù)授予了單細(xì)胞基因測序（Single Cell Sequencing），認(rèn)為該技術(shù)將改變生物界和醫(yī)學(xué)界的許多領(lǐng)域。
我們?yōu)槭裁匆M(jìn)行單細(xì)胞基因測序？
傳統(tǒng)的測序方法，無論是基因芯片或者二代基因測序技術(shù)（Next Generation Sequencing，NGS）都需要從超過10萬個(gè)細(xì)胞中提取一大堆（bulk）DNA或者RNA，而提供的信息是一大堆細(xì)胞的平均值。但是傳統(tǒng)的方法，對于理解人體細(xì)胞的多樣性有著明顯的局限性。
在人體的每一個(gè)組織中，比如說，腎臟組織，擁有著大量不同的細(xì)胞類型，每一種細(xì)胞類型有著獨(dú)特的起源和功能。每一個(gè)細(xì)胞的譜系和發(fā)展的狀態(tài)又決定了每個(gè)細(xì)胞如何和周圍的細(xì)胞和環(huán)境如何反應(yīng)，把基因測序應(yīng)用到單個(gè)細(xì)胞層面，對于我們理解細(xì)胞的起源，功能，變異等有著至關(guān)重要的作用。
關(guān)于二代基因測序已經(jīng)詳細(xì)在我們的前期兩篇深度報(bào)告中進(jìn)行了介紹，在本篇報(bào)告中，我們將詳細(xì)解讀單細(xì)胞基因測序，以及該技術(shù)對癌癥，輔助生殖以及免疫學(xué)等領(lǐng)域帶來的新的突破。
一、單細(xì)胞基因測序行業(yè)：剛啟程，面臨引爆點(diǎn)
BCC Research的一項(xiàng)分析報(bào)告指出，2014年全球單細(xì)胞分析（Single-cell Analysis）的市場達(dá)5.4億美金，預(yù)測將從2015年的6.3億美金增長到2020年的16億美金，復(fù)合增長率達(dá)21%。根據(jù)GENReports的報(bào)告，關(guān)于單細(xì)胞分析的文章發(fā)表在過去的幾年也有著爆發(fā)性的增長。
圖2：單細(xì)胞分析的文章發(fā)表數(shù)量
資料來源：GEN，民生證券研究院
其中，傳統(tǒng)的單細(xì)胞基因組學(xué)主要是由基因芯片和PCR主導(dǎo)的，隨著二代基因測序的成本以超摩爾定律下降，目前單細(xì)胞基因組學(xué)逐漸由二代基因測序技術(shù)接棒。
和qPCR在90年代的發(fā)展一樣，目前所有的刺激因素（高度的科研興趣，生物醫(yī)藥巨頭公司的關(guān)注等）正在解鎖這個(gè)市場，單細(xì)胞基因測序行業(yè)正面臨引爆點(diǎn)。
二、單細(xì)胞基因測序的基本流程：單細(xì)胞分離--基因組擴(kuò)增--測序和分析
單細(xì)胞測序，簡單地說，主要經(jīng)過如下的步驟：單細(xì)胞的分離--DNA/RNA的提取和擴(kuò)增（全基因組擴(kuò)增和全轉(zhuǎn)錄組擴(kuò)增）---測序以及后續(xù)的分析和應(yīng)用。
圖3：單細(xì)胞測序的步驟
資料來源：Recent advances and current issues in single-cell sequencing of tumors，民生證券研究院
2.1 單細(xì)胞的捕捉和分離
單細(xì)胞測序的第一步是單細(xì)胞的分離和提取，目前的方法主要有如下幾種方法：流式細(xì)胞術(shù)，激光捕獲顯微切割技術(shù)以及微流控技術(shù)。
圖4：單細(xì)胞分離的三種方式：流式細(xì)胞術(shù)，激光捕獲顯微切割以及微流控技術(shù)
資料來源：Technologies for Single-Cell Isolation，民生證券研究院
1）流式細(xì)胞術(shù) （Flow Cytometry）
是指通過對于懸浮于流體中的細(xì)胞或者其他顆粒進(jìn)行定量分析和分選的技術(shù)。在各種流式細(xì)胞儀中，大家主要討論的是熒光活化細(xì)胞分類計(jì)FACS（Fluorescence Activated Cell Sorting）系統(tǒng)分離單細(xì)胞。定量原理：待測細(xì)胞經(jīng)特異性熒光染料染色后，加入樣品管中，經(jīng)過測量區(qū)，由染色后的細(xì)胞在激光照射下的熒光產(chǎn)生的電信號來進(jìn)行定量分析；分選原理：通過流束形成含有細(xì)胞的帶電液滴來實(shí)現(xiàn)的。
2）激光捕獲顯微切割技術(shù)Laser Capture Microdissection（LCM）
LCM技術(shù)可以在顯微鏡直視下快速、準(zhǔn)確獲取所需的單一細(xì)胞亞群，甚至單個(gè)細(xì)胞，從而成功解決了組織中細(xì)胞異質(zhì)性問題。其基本原理是通過一低能紅外激光脈沖激活熱塑模-乙烯乙酸乙烯酯（EVA）膜，在直視下選擇性地將目標(biāo)細(xì)胞或組織碎片粘到該膜上。
3）微流控技術(shù)（Microfluidics）
微流控技術(shù)是一種用于精確控制微量液體的技術(shù)。微流控芯片是實(shí)施該技術(shù)的平臺，通常通過細(xì)微的管道對液體實(shí)施操控，微流控對液體的操控尺度， 剛好適合于單細(xì)胞樣品的處理操作。
2.2 全基因組擴(kuò)增 （Whole Genome Amplification. WGA）/ 全轉(zhuǎn)錄組擴(kuò)增 （Whole Transcriptome Amplification，WTA）：單細(xì)胞測序的難點(diǎn)
2.2.1 主要的三種全基因組擴(kuò)增技術(shù)，各有優(yōu)勢
由于在單細(xì)胞中的DNA和RNA的數(shù)量非常?。◣讉€(gè)pg），用傳統(tǒng)的測序儀無法檢測，所以科學(xué)家們必須首先對這些分子進(jìn)行擴(kuò)增，同時(shí)盡量的減少錯(cuò)誤。目前的全基因組擴(kuò)增技術(shù)主要有三種：簡并寡核苷酸引物PCR擴(kuò)增（DOP-PCR），多重置換擴(kuò)增（MDA）；和基于多次退火和成環(huán)的擴(kuò)增循環(huán)（MALBAC）。
1）基于PCR技術(shù)的全基因組擴(kuò)增技術(shù)，例如DOP-PCR（簡并寡核苷酸引物PCR擴(kuò)增）
DOP-PCR是一種部分隨機(jī)引物法， 其引物構(gòu)成為3′-ATGTGG-NNNNNN-CCGACTCGAG-5′， 主要 利用3′端ATGTGG這6個(gè)在人體中分布頻率極高的堿基作為引導(dǎo)， 以6個(gè)堿基的隨機(jī)序列來決定特異的擴(kuò)增起始位點(diǎn)，從而達(dá)到擴(kuò)增整個(gè)基因組的目的。2）多重置換擴(kuò)增（MDA）MDA是一種等溫的鏈置換擴(kuò)增反應(yīng)， 其使用隨機(jī)的6堿基引物在多位點(diǎn)和模板鏈結(jié)合， 接著利用 phi29DNA 聚合酶很強(qiáng)的模板結(jié)合和置換能力實(shí)現(xiàn)對全基因組的擴(kuò)增。
圖5：DOP-PCR和MDA全基因組擴(kuò)增技術(shù)簡介
資料來源：Single-cell genome sequencing： current state of the science，民生證券研究院
3）MALBAC（Multiple annealing and looping-based amplification cycles）基于多次退火和成環(huán)的擴(kuò)增循環(huán)
通過采用特殊引物，使得擴(kuò)增子的結(jié)尾互補(bǔ)而成環(huán)，從而達(dá)到近乎線性的擴(kuò)增，該技術(shù)是哈佛大學(xué)謝曉亮教授團(tuán)隊(duì)發(fā)明的。
圖6：MALBAC全基因組擴(kuò)增的示意圖
資料來源：Single-cell sequencing by Doug Brutlag，民生證券研究院
表1：三種類型的全基因組擴(kuò)增方式比較
資料來源：Single-Cell Sequencing Technologies： Current and Future，民生證券研究院
Navin 在研究報(bào)告中指出（來源：Cancer genomics： one cell at a time），對于檢測CNV（Copy Number Variation）的時(shí)候，DOP-PCR以及MALBAC較有優(yōu)勢，另一方面， MDA方法一般用來檢測點(diǎn)突變。Gawad et al.， （2015）更是指出，三種全基因組擴(kuò)增技術(shù)并沒有明顯的勝者，具體方法的使用取決于研究的目的。
2.2.2 全轉(zhuǎn)錄組擴(kuò)增
一個(gè)哺乳動(dòng)物的單細(xì)胞大約含有10pg的RNA，其中mRNA大約在0.1-0.5pg，并不能滿足目前測序平臺的要求，所以需要進(jìn)行全轉(zhuǎn)錄組擴(kuò)增技術(shù)。
單細(xì)胞中提取的RNA首先經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄出cDNA，然后對逆轉(zhuǎn)錄生成的cDNA進(jìn)行擴(kuò)增。目前主要的轉(zhuǎn)錄組擴(kuò)增技術(shù)主要包括如下幾種：傳統(tǒng)的PCR，改進(jìn)的PCR，T7-in vitro 體外轉(zhuǎn)錄組擴(kuò)增以及Phi29聚合酶擴(kuò)增。
三、單細(xì)胞測序的主要應(yīng)用：癌癥，輔助生殖以及免疫學(xué)領(lǐng)域
當(dāng)單細(xì)胞被分離，細(xì)胞內(nèi)的DNA/RNA被提取和擴(kuò)增后，二代基因測序（Next Generation Sequencing）可以用來進(jìn)行后續(xù)的測序。當(dāng)把基因測序應(yīng)用于單個(gè)細(xì)胞層面，在下游應(yīng)用領(lǐng)域有著先天獨(dú)到的優(yōu)勢。
3.1單細(xì)胞基因測序技術(shù)有助研究癌癥起因和治療
首先談一下癌癥的異質(zhì)性：中晚期的腫瘤或由一系列的腫瘤克隆組成，每一種克隆有著獨(dú)立的變異，形態(tài)和藥物反應(yīng)。對于腫瘤克隆精準(zhǔn)的診斷非常重要，因?yàn)橐粋€(gè)占據(jù)原發(fā)性腫瘤5.1%的亞克隆種群在復(fù)發(fā)的時(shí)候可能成為主要的致病因素。
圖7：腫瘤的異質(zhì)性
資料來源：Illumina，民生證券研究院
實(shí)體瘤由一系列不同的細(xì)胞組成，包括癌癥纖維細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞，淋巴細(xì)胞，巨噬細(xì)胞等。同時(shí)，實(shí)體瘤由多個(gè)腫瘤克隆亞種群構(gòu)成，使得臨床樣本的分析更加復(fù)雜。當(dāng)多個(gè)腫瘤克隆同時(shí)存在時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)方法檢測的要么是平均信號要么是主要的克隆群體（并不一定是最致病的）的信號。
而同時(shí)，腫瘤的異質(zhì)性和癌癥產(chǎn)生抗藥性以及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，所以，單細(xì)胞測序開始用來檢測腫瘤內(nèi)基因異質(zhì)性，對于癌癥起因以及后續(xù)治療的研究非常關(guān)鍵和重要。
例如，Navin et al.（2011）， 利用單細(xì)胞基因測序的方法（流式細(xì)胞術(shù)提取細(xì)胞-全基因組擴(kuò)增-NGS），在某個(gè)乳腺癌腫瘤組織中檢測了100個(gè)乳腺癌細(xì)胞的CNVs，覆蓋度大約6%，發(fā)現(xiàn)了三種完全不一樣的克隆亞種群。
除了腫瘤細(xì)胞，單細(xì)胞基因測序同樣可以應(yīng)用于循環(huán)腫瘤細(xì)胞（Circulating tumor cells）和外周血播散腫瘤細(xì)胞DTC（disseminated tumor cells），該部分內(nèi)容將在后續(xù)的研究報(bào)告中深入討論。
3.2 單細(xì)胞基因測序助力輔助生殖
PGS（Pre-implantation Genetic Screening）是胚胎注入前遺傳學(xué)篩查，主要是通過檢測胚胎的23對染色體結(jié)構(gòu)、數(shù)目，來分析胚胎是否有遺傳物質(zhì)異常；PGD（Pre？implantation Genetic Diagnosis），主要用于檢測胚胎是否攜帶遺傳缺陷的基因，關(guān)于PGS/PGD的介紹，請參考我們之前的行業(yè)深度《基因+大數(shù)據(jù)的顛覆：從癌癥基因測序到輔助生殖》。
PGD過程中，目前主要有三種方式獲得活檢材料：1）卵子的第一極體和第二極體；2）培養(yǎng)至第3天胚胎卵裂期的卵裂球細(xì)胞（一般取1-2個(gè)細(xì)胞）；3）培養(yǎng)第5天左右的囊胚細(xì)胞。
例如，牛津大學(xué)的Dr.Dagan Wells團(tuán)隊(duì)，通過對囊胚細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞基因測序，選擇健康的胚胎植入。另外，謝曉亮教授團(tuán)隊(duì)通過對女方卵細(xì)胞極體細(xì)胞進(jìn)行測序，結(jié)合胚胎選擇，選擇正常的胚胎移植。
圖8：卵母細(xì)胞減數(shù)分裂產(chǎn)生極體的過程
資料來源：Genome Analyses of Single Human Oocytes，民生證券研究院
（注：其中PB1和PB2是第一極體和第二極體）
3.3 單細(xì)胞基因測序打開免疫報(bào)多樣性研究之門
用單細(xì)胞基因測序分析免疫細(xì)胞的原因是現(xiàn)存的多樣的病原體導(dǎo)致了免疫細(xì)胞的高度異質(zhì)性，傳統(tǒng)的檢測方法，取樣來自一大堆細(xì)胞，低估了單個(gè)免疫細(xì)胞的多樣性，所以我們需要更加精確檢測單個(gè)免疫細(xì)胞的遺傳物質(zhì)，從而理解機(jī)體復(fù)雜的免疫機(jī)制。正如開篇提到的Juno收購的單細(xì)胞基因測序公司AbVitro致力于T細(xì)胞和B細(xì)胞的基因測序。
圖9展示了對單個(gè)T細(xì)胞受體基因測序（TCR Sequencing）的流程。TCR α和βmRNA經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄，擴(kuò)增，重疊延伸，目的基因被選擇性地進(jìn)行PCR擴(kuò)增以及后續(xù)的分析。
圖9：TCR Sequencing過程
資料來源：Pairing of T-cell receptor chains via emulsion PCR，Illumina，民生證券研究院
四、單細(xì)胞基因測序未來的發(fā)展之路
在目前來看，單細(xì)胞基因測序還處在非常初級的階段，也面臨很多技術(shù)的挑戰(zhàn)，包括：如何高效的分離細(xì)胞，全基因組無偏差的擴(kuò)增，以及下游的數(shù)據(jù)分析等。但各大生物醫(yī)藥巨頭都已經(jīng)目光鎖定了這個(gè)方向，除了今年初Juno收購AbVitro（單個(gè)T細(xì)胞和B細(xì)胞進(jìn)行基因測序），去年八月BD公司收購了單細(xì)胞測序公司Cellular Research。Illumina也通過和Clontech合作，推出了單細(xì)胞RNA測序服務(wù)。
我們認(rèn)為，未來的基因測序一定朝著更精準(zhǔn)，更微觀的方向前進(jìn)，如今，單細(xì)胞測序正面臨著一場革命，在單個(gè)細(xì)胞層面讓我們在前所未有的水平理解基因組學(xué)，表觀基因組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)的多樣性。
背景案例：
2016年1月，腫瘤免疫療法的領(lǐng)頭羊公司Juno宣布以1.25億美金的股票和現(xiàn)金收購波士頓的一家單細(xì)胞測序公司：AbVitro Inc.。 AbVitro公司的技術(shù)起源于哈佛大學(xué)George Church的實(shí)驗(yàn)室，AbVitro的技術(shù)包括對單個(gè)T細(xì)胞和B細(xì)胞進(jìn)行基因測序，幫助科學(xué)家們理解T細(xì)胞受體（T cell receptor）α和β鏈的基因的復(fù)雜性。
圖：Juno收購AbVitro之后的布局
